روش آنزیمی کلاژن

l 

l الگوی الکتروفورز کلاژن پس از نمک زدن.

استخراج آنزیمی به این معنی است که پس از استخراج کلاژن محلول و کلاژن محلول در اسید، برخی از پروتئازها مانند کلاژناز، پپسین، پاپائین و کیموتریپسین برای به دست آوردن کلاژن های مختلف محلول در آنزیم باید هیدرولیز شوند. پروتئازهای مورد استفاده عمدتاً به 3 نوع تقسیم می شوند: پروتئازهای حیوانی (مانند تریپسین، پپسین)، پروتئازهای گیاهی (مانند پاپائین، بروملین)، و پروتئازهای میکروبی (مانند پروتئازهای قلیایی، پروتئازهای خنثی). در تحقیقات هیدرولیز آنزیمی کلاژن، پروتئاز قلیایی بیشترین استفاده را دارد.

کلاژن به روشی محدود تجزیه می شود، یعنی پپتید پایانی شکافته می شود. از آنجایی که پیوندهای کووالانسی بین زنجیره های پپتیدی کلاژن در اثر برهمکنش لیزین یا هیدروکسی لیزین در پپتید انتهایی مولکولی ایجاد می شود، پپتید انتهایی شکاف می شود. قسمت اصلی حاوی ساختار مارپیچ سه گانه را می توان در اسیدهای آلی رقیق حل کرد و استخراج کرد. درمان آنزیمی می تواند پپتید انتهایی فیبرین کلاژن را هیدرولیز کند، عملکرد کلاژن را بهبود بخشد. و ساختار مارپیچ سه گانه کلاژن را از بین نمی برد و ویژگی های آن را حفظ نمی کند. عوامل زیادی بر استخراج آنزیم تأثیر می گذارند، مانند غلظت آنزیم، نسبت آنزیم به سوبسترا، زمان هیدرولیز آنزیمی، دمای هیدرولیز آنزیمی، مقدار pH و نسبت ماده به مایع. در عملیات واقعی، بیشتر کلاژن به روش ترکیب آنزیمی استخراج می شود و بیشتر توسط پپسین استخراج می شود و اسید آلی بیشتر اسید استیک است.

l الکتروفروگرام کلاژن استخراج شده با پپسین

فرآیند هیدرولیز آنزیمی کلاژن عمدتا به روش هیدرولیز تک آنزیمی و روش هیدرولیز چند آنزیمی تقسیم می شود. روش هیدرولیز چند آنزیمی بیشتر به روش هیدرولیز آنزیمی مخلوط (مانند تریپسین گاوی، پروناز، باسیلوس پروتئاز مخلوط) و روش هیدرولیز آنزیمی گام به گام تقسیم می شود. انتخاب فرآیند و شرایط آزمایشی خاص برای استخراج آنزیمی کلاژن پوست معمولاً باید ایجاد شود. برای به دست آوردن پلی پپتیدهای کلاژن با وزن مولکولی کوچکتر، معمولاً از هیدرولیز چند آنزیمی استفاده می شود. عوامل اصلی موثر بر اثر آنزیمولیز عبارتند از: نوع آنزیم، مقدار آنزیم اضافه شده، دمای آنزیمولیز، زمان آنزیمولیز، مقدار pH و نسبت ماده به آب. استفاده از استخراج آنزیمی کلاژن در سنگدانه ها نه تنها می تواند به طور موثر زمان استخراج را کوتاه کند، بلکه کلاژن را با فعالیت بیولوژیکی خوب به دست آورد و آلودگی محیط نیز کم است. کلاژن به راحتی توسط پروتئاز معمولی هیدرولیز نمی شود، اما می تواند توسط کلاژناز حیوانی شکسته شود و قطعات شکسته شده می توانند پس از دناتوره شدن خودکار توسط پروتئاز مشترک هیدرولیز شوند. شرایط مناسب برای هیدرولیز کلاژن پپسین pH 1.{7}}.70 و دمای 37 درجه است.

برخی افراد از استخوان خوک به عنوان مواد خام استفاده می کنند و از واکنش هیدرولیز آنزیمی پروتئاز برای جایگزینی فرآیند ساخت چسب سنتی و انجام تحقیقات تجربی در مورد واکنش هیدرولیز آنزیمی کلاژن و فرآیند ساخت چسب آنزیمی استفاده می کنند. نتایج نشان داد که پپسین دارای بالاترین میزان استخراج کلاژن (46.14 درصد)، تریپسین (43.42 درصد)، پروتئاز خنثی (3{10}}.14 درصد) و پروتئاز قلیایی (21.15 درصد) است. عوامل مؤثر در واکنش هیدرولیز آنزیمی پپسین با آزمایش‌های تک فاکتوری و متعامد بهینه شدند. نتایج آزمایش نشان می دهد که شرایط بهینه برای استخراج پپسین این است که غلظت پپسین 1 درصد باشد، هیدرولیز آنزیمی در pH 2.0 به مدت 48 ساعت انجام شود و سپس در محلول NaCl با غلظت 10 درصد (w/v) نمک زده شود. ) به مدت 24 ساعت. نرخ بازیابی نهایی کلاژن 64.77 درصد و میزان استخراج کلاژن 49.75 درصد بود. برخی از افراد همچنین از پپسین برای استخراج کلاژن پوست خوک استفاده کردند و چهار دوز مختلف پپسین (1 درصد، 2 درصد، 2.5 درصد، 3 درصد) را برای نمونه گیری و آزمایش هیدرولیز کردند، از معادله HILL مرتبه اول برای شبیه سازی فرآیند استخراج پپسین استفاده شد. کلاژن پوست خوک و فرآیند پوسیدگی سرعت هیدرولیز پپسین و در نهایت میزان استخراج 2 درصد دوز پپسین و زمان هیدرولیز ساعت 6-7 بدست آمد. بیشترین. برخی افراد از پوست تازه خوک به عنوان ماده خام استفاده می کنند، با تریپسین تحت شرایط 50-52 درجه هیدرولیز می کنند، دوز آنزیم 5000:1 ~ 10000:1، مقدار pH 9، واکنش 2-3 است. ساعت، ماده خام: آب تحت شرایط 1:2 هیدرولیز آنزیمی است. نتایج نشان داد که میزان استخراج پروتئین کل بیشتر یا مساوی 80 درصد بود.

l میزان بازیابی کلاژن در پوست ماهی مرکب توسط پپسین در دمای متغیر.

هنگام استفاده از روش آنزیمی برای استخراج کلاژن، شرایط استخراج باید به شدت کنترل شود:

ابتدا باید زمان عمل آنزیم مناسب باشد. اگر زمان خیلی کوتاه باشد، کلاژن به طور کامل در عصاره آزاد نمی شود، که بر سرعت استخراج تأثیر می گذارد. اگر زمان عمل آنزیم بیش از حد طولانی باشد، کلاژن بیش از حد هیدرولیز می شود و در نتیجه الیگوپپتید مولکولی کوچک بسیار تلخ ایجاد می شود که نه تنها کارایی جداسازی و تصفیه را افزایش می دهد، بلکه بر خواص عملکردی و فعالیت بیولوژیکی کلاژن نیز تأثیر می گذارد.

دوم اینکه دمای هیدرولیز آنزیمی باید مناسب باشد. اگر دما خیلی پایین باشد، اثر آنزیم آشکار نیست. اگر دما خیلی بالا باشد باعث غیرفعال شدن آنزیم و دناتوره شدن کلاژن می شود. طبق گزارشات، زمانی که PH محیط کمی کمتر از خنثی باشد، دمای دناتوره شدن کلاژن 40-41 درجه است، زمانی که pH محیط اسیدی باشد، دمای دناتوره شدن کلاژن 38-39 درجه است. و دمای دناتوره شدن کلاژن پوست ماهی 7-12 درجه کمتر از دمای دناتوره شدن کلاژن پوست خوک است. بنابراین، اگر قرار است کلاژن استخراج شده فعالیت بیولوژیکی خوبی داشته باشد، دمای استخراج باید کمتر از دمای دناتوراسیون در طول فرآیند استخراج باشد.

سوم، آنزیم مناسب باید انتخاب شود. به طور کلی، هنگام استخراج کلاژن از بافت پستانداران خشکی، استفاده از پپسین برای استخراج در دمای مطلوب آن منطقی است، اما برای حیوانات آبزی مانند ماهی، دمای دناتوره شدن کلاژن کمتر از پستانداران خشکی است. بنابراین، بسیاری از پروتئازها مناسب نیستند و برخی از خواص عملکردی و فعالیت های بیولوژیکی کلاژن ممکن است در صورت استخراج در دمای بهینه برای این آنزیم ها از بین بروند. تحقیقات در مورد استخراج کلاژن و پلی پپتیدهای آن به روش های آنزیمی عمدتاً از پوست حیوانات و فرآورده های جانبی آنها است و گزارش های کمی در مورد استفاده از روش های آنزیمی برای استخراج کلاژن و پلی پپتیدهای آن از استخوان های حیوانات وجود دارد.